Arbeitsbereich Prof. Dr. Jürgen Brosius

Neuronale BC1 RNA und BC 200 RNA

Unser spezielles Interesse gilt u.a. der BC1 RNA, ein RNA Polymerase III Transkript, welches ausschließlich in Nagern gefunden wird, sowie der BC200 RNA, eine RNA Polymerase III Transkript anthropoider Primaten. Diese kurzen zytoplasmatischen nicht-Boten RNAs (152 bzw. 200 nt) sind nicht homolog und entstammen aus zwei unterschiedlichen Vorläufern. BC1 RNA ist ein Retronuon, welches von tRNAAla nach der Abspaltung der Säuger, aber vor der Gruppierung der Nager in zwei Unterordnungen, vor ca. 60-110 Millionen Jahren entstanden ist. In vivo und unter Verwendung von Extrakten des Rattenhirns sind sowohl Elemente oberhalb der RNA kodierenden Region als auch innerhalb des Genes für eine effiziente Transkription notwendig. Die RNA kodierende Region enthält neben der von der tRNA- abstammenden Domäne eine zentrale A-reiche Region von etwa 50 Nukleotiden, eines der Markenzeichen der Retroposition, und etwa 30 Nukleotide einer Sequenz, welche oberhalb des RNA Polymerase III Transkription Terminators lokalisiert ist. Diese 3' Domäne wurde von einem einzigen genomischen Ort der Integration rekrutiert, welche in der Maus auf dem Chromosom 7 nahe Fgf3 (1) liegt. BC1 ist das erste identifizierte Master-Gen einer Unterklasse der SINEs, nämlich der ID repetitiven Elemente der Nager (22-24). Trotz der ca. 75%igen Sequenzähnlichkeit zwischen tRNAAla und der korrespondierenden Sequenz der BC1 RNA faltet sich diese Domäne nicht wie eine tRNA, sondern formiert eine stabile Stammschlinge mit einigen internen Loops und Ausbuchtungen. BC200 RNA entstand ebenfalls durch Retroposition und beinhaltet eine der wenigen transkriptionsaktiven monomeren Alu-Elemente. Die einzige Genkopie liegt auf dem humanen Chromosom 2p15 (5). Seine 5' Domäne entspricht der Alu Domäne der SRP RNA und sie bindet das Protein Dimer SRP 9/14 (6-7) in vitro und in vivo. Die zentrale Domäne ist A-reich, gefolgt von ungefähr 30 Nukleotiden, welche vom Ort der genomischen Integration rekrutiert wurde. BC200 RNA wurde in allen untersuchten anthropoiden Primaten gefunden, einschließlich Neu- und Altweltaffen sowie dem Menschen (8). Da das BC200 snmRNA kodierende Gen in Halbaffen (Galago, Lemur und Tarsier) fehlt, ist sein Alter mit 35-55 MYA signifikant jünger, als das seines Analogons aus Nagern (9). Im humanen Genom ist BC200 das Quellgen von mehr als 200 Pseudogenen (die meisten von ihnen Retronuons). Trotz ihrer unterschiedlichen Ursprünge könnten BC1 RNA und BC200 RNA, beide Teil des Ribonukleoproteinkomplexes (RNPs) (10,11), funktionelle Analoga darstellen, da sie nahezu ausschließlich in Nervenzellen exprimiert werden (12-18). In Neuronen sind sowohl die BC1 RNA als auch die BC200 RNA, nicht nur in den Zellkörpern (Soma) sondern auch in distalen Regionen dendritischer Fortsätze lokalisiert (12,13). Zumindest der Beginn der Expression von Nager BC1 RNA korreliert mit synaptischer Aktivität (19). In Dendriten können nicht nur ausgewählte mRNAs gefunden werden, sondern auch alle Komponenten des Translationsapparates (20). Die lokale Translation dendritischer mRNAs an postsynaptischen Orten wird als ein wichtiger molekularer Mechanismus in Betracht gezogen, welcher der Wartung und Modulation von synaptischen Strukturen und Funktionen unterliegt, die wiederum relevant für Prozesse wie das Lernen und das Gedächtnis sind (21). Wir erforschen im Moment in enger Zusammenarbeit mit dem Labor von Henri Tiedge an der SUNY Brooklyn, NY, USA, unter Verwendung biochemischer, transgener Mäuse und zielgerichteter Gendeletionen (knock-out), die Funktionen dieser ungewöhnlichen RNAs sowie die bestimmenden Faktoren, welche für die dendritische Lokalisation notwendig sind. Es ist möglich, dass RNAs im Komplex mit Proteinen als RNPs (10,11) in regulatorische Aspekte dendritischer Translation verwickelt sind und subtile aber wichtige funktionelle Aufgaben bei diesen Prozessen ausüben (12-20). Das humane Analogon, BC200 RNA, könnte eine Rolle bei neuropsychiatrischen Erkrankungen spielen. Zusätzlich fanden wir, dass BC200 RNA in vielen menschlichen Tumoren disreguliert ist, während sie in benachbartem normalen Gewebe nicht nachweisbar ist (22).

Identifizierung der kleinen nicht protein-kodierenden, stabilen RNAs (snmRNAs) in der Zelle

Eines der Ziele der Aufschlüsselung der Sequenz des gesamten humanen Genoms ist die Identifikation aller Gene. Ein wenig überraschend ist die Tatsache, dass es nur ca. 30.000 Gene beinhaltet, kaum 50% mehr als bei dem Nemathoden Caenorhabditis elegans und fast identisch zu der Anzahl bei anderen Wirbeltieren, wie dem Pufferfisch Fugu, mit dem wir einen Vorfahren vor mehr als einer halben Billionen Jahren teilen. Wegen des Vorhandenseins offener Leserahmen, Spleißstellensignalen und anderer Kennzeichen, ist es verhältnismäßig unkompliziert, Gene zu identifizieren, die Proteine verschlüsseln. Dies ist der Grund, warum es nicht zu viel Hoffnung gibt, dass die Zahl menschlicher Gene noch erheblich steigen wird. Die Bemühungen, die Proteine kodierenden Gene durch Komplementäranalysen aus mRNA-abgeleiteten cDNA Klonen zu identifizieren (genannt ESTs, expressed sequence tags) ist für die Interpretation der Humangenomsequenzdaten sehr wertvoll. Dieser Versuchsansatz ist auch deshalb in hohem Maße bedeutend, da ein großer Grad an Varianten mit einer begrenzten Anzahl von Genen erzielt wird, z.B. durch alternatives Spleißen gleicher Vorläufer hnRNA (s.o.). Bei den Wirbeltieren gibt es mehr Variationsmöglichkeiten hinsichtlich alternativer Spleißstellenmuster (einschließlich der Rekrutierung von neuen Exons aus Introns und anderen nicht kodierenden Regionen (6, 23-26, 27)) als durch bloße Erhöhung der Genzahlen. Dies ist einer der Gründe für die Bedeutung von ESTs. Es ist fast unmöglich, nicht-kodierende RNAs einschließlich der meisten snmRNAs allein aus einer genomischen Sequenz vorauszusagen(28). Eine experimentelle Annäherung ist obligatorisch. Wir adaptierten einen EST-ähnlichen Versuchsansatz für kleine RNAs und legten Bibliotheken mit Gesamt-RNA vom Mäusegehirn in der Größenordnung von ~50-500 Nukleotiden an. Wie erwartet, stammten mehr als 90% der Sequenz - wir benannten sie ERNS für expressed RNA sequences - von bekannten, reichlich vorhandenen snmRNAs wie 5S und 5.8S rRNA ab. Folglich applizierten wir die Bibliotheken auf Filter (gemeinsam mit Hans Lehrach und Mitarbeitern, Max-Planck-Institut für molekulare Genetik, Berlin) und hybridisierten sie mit Proben, die von bekannten snmRNAs abstammten. Anschließend sequenzierten wir nur Klone mit geringem oder keinem Hybridationssignal. Bis jetzt identifizierten wir auf diese Weise mehr als 200 ERNS, welche möglicherweise neuen snmRNAs entsprechen (31). Z.B. entdeckten wir 113 neue kleine Nukleolar-RNAs (snoRNAs) sowohl von der Unterklasse der Box C/D als auch der Box H/ACA, bekannt als guide RNAs für rRNA. (Die Analyse von ERNS erfolgt gemeinsam mit der Gruppe um Jean-Pierre Bachelleries bei CNRS, Toulouse.) Während nur 30 ERNS Mäusehomologa schon identifizierter menschlicher C/D oder H/ACA snoRNAs darstellen, entsprechen 83 völlig neuen snoRNAs. Bis vor kurzem war die einzige bekannte Funktion von snoRNAs die direkte Methylierung oder Pseudouridylierung von ribosomalen RNAs. Die meisten der 83 neuen ERNS erfüllten diese Erwartung insofern, als dass nach unserer Entdeckung von 24 neuen rRNA-Methylierungs-guide snoRNAs, nur 14 der 105-107 Ribosemethylierungen der Säugetier-rRNAs auch weiterhin ohne eine bekannte verwandte Antisense Box C/d snoRNAs bleiben. Wir identifizierten darüber hinaus auch einige snoRNAs beider Unterklassen, die möglicherweise als guide RNAs für vorausgesagte Modifikationen in den U-Typ snRNAs dienen. Die große Überraschung war, dass 25 snoRNAs von jeder Kategorie gefunden wurden, welchen Antisense-Elemente für rRNAs oder snRNAs fehlten. Folglich müssen zusätzliche snoRNA Ziele einschließlich anderer nicht-Boten oder sogar Boten RNAs in Betracht gezogen werden. In Einklang mit der letzten Möglichkeit, werden sechs C-/D Box snoRNAs und eine H-/ACA Box snoRNA ausschließlich im Gehirn exprimiert (29-30). Eine dieser snoRNAs (MBII-52 in der Maus beziehungsweise menschliches HBII-52), zeigt mit 18 Nukleotiden eine Komplementarität zur gehirnspezifischen Serotoninrezeptor 5-HT2C mRNA (29). Von den restlichen 88 ERNS, die keiner der snoRNA Unterklassen zugeordnet werden können, werden ca. 30 vermutlich von abgespalteten hnRNAs oder von mRNAs abstammen. Die restlichen ERNS konnten bisher weder irgendeiner snmRNA Klasse noch einem Teil einer größeren nRNA/mRNA zugewiesen werden. Es ist wahrscheinlich, dass zumindest einige dieser 57 ERNS neue, bisher nicht klassifizierte snmRNAs darstellen. Abgesehen von der Maus als Modellorganismus verwenden wir diesen Versuchsansatz für die Identifizierung von neuen snmRNAs in Escherichia coli, in Archaea, in der Hefe, in Caenorhabditis elegans, in Drosophila melanogaster, in Arabidopsis thaliana und im Menschen. Im Laufe der Zeit wird dies zu Studien über die Struktur, Expression, Funktion und die Rolle in den genetischen Krankheiten und der Pharmakogenetik von snmRNAs führen. Drei der sieben gehirnspezifischen snoRNAs werden auf Chromosom15q11-13, an dem Ort, der mit dem Prader-Willi Syndrom (PWS) in Verbindung gebracht wird, exprimiert und sind, erstmalig für snmRNAs beschrieben, väterlich geprägt sowie abwesend in PWS Patienten (29-30). Dieses ist ein starker Hinweis darauf, dass RNomics für die molekulare Medizin wichtiger zu sein scheint, als je vorhergesagt.

Veröffentlichungen:

Brosius, J.: Genomes were forged by massive bombardments with retroelements and retrosequences. Genetica 107, 209-238. 7. Brosius, J., Kreitman, M. (2000) Eugenics - evolutionary nonsense? Nat. Genet. 25, 253, 1999

Brosius, J., Kreitman, M.: Eugenics - evolutionary nonsense? Nat. Genet. 25, 253, 2000

Brosius, J.: RNAs from all categories generate retrosequences that may be exapted as novel genes or regulatory elements. Gene 238, 115-134, 1999

Brosius, J.: Many G-coupled receptors are encoded by retrogenes. Trends Genet. 14, 304-305, 1999

Cavaillé, J., Buiting, K., Kiefmann, M., Lalande, M., Brannan, C.I., Horsthemke, B., Bachellerie, J.-P., Brosius, J., Hüttenhofer, A. Cavaillé, J., Buiting, K., Kiefmann, M., Lalande, M., Brannan, C.I., Horsthemke, B., Bachellerie, J.-P., Brosius, J., Hüttenhofer, A.: Identification of brain-specific and imprinted small nucleolar RNA genes exhibiting an unusual genomic organization. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 14311-14316, 2000