Struktur und Funktion der Metzinkine am Beispiel des prototypischen Astacins

Im Arbeitsbereich Molekulare Physiologie werden Enzyme der Astacin-Familie von Zink-Peptidasen untersucht, die nach ihrem Prototyp, der Kollagen-spaltenden Verdauungsprotease Astacin aus dem Flusskrebs Astacus astacus L. benannt ist. Neben Verdauungsenzymen umfasst die Astacin-Familie extrazelluläre Proteasen und Zelloberflächen-Proteasen, die durch limitierte Proteolyse die Assemblierung der extrazellulären Matrix und die Wechselwirkungen zwischen Zellen und der Matrix regulieren. Beispiele sind die membrangebundenen Meprine der Bürstensaummembranen von Dünndarm und Niere und die Prokollagen C-Proteinase (BMP1, i.e. bone morphogenetic protein), die für den korrekten Aufbau von Kollagenfasern essentiell ist und daher ein therapeutisches Ziel bei der Behandlung fibrotischer Erkrankungen darstellt. Aus Strukturuntersuchungen am Astacin, an Matrix-Metalloproteinasen, Schlangengift-Proteasen und der bakteriellen Serralysine entwickelten wir das Konzept einer Superfamilie von Zink-Peptidasen, der Metzinkine. Die molekularen Grundlagen der funktionellen Diversifikation dieser Proteinfamilie, die grundlegende Prozesse der Embryonalentwicklung und Gewebedifferenzierung katalysiert, sind noch weitgehend unerforscht. Wir wollen verstehen wie Astacin-ähnliche Proteasen in biologischen Systemen funktionieren. Zu diesem Zweck benutzen wir heterologe Systeme zur Überexpression dieser Proteine in ihrer ursprünglichen Form oder als mutierte Enzyme in Bakterien, in Hefe, in Insektenzellen und in Säugerzellinien. Wir wenden Absorptionsphotometrie, Fluoreszenzphotometrie, Stopped-Flow-Kinetik, Plasmon-Resonanz und molekulares Modellieren an, um die Wechselwirkung der Enzyme mit Substraten, Inhibitoren und anderen Matrixproteinen zu analysieren. Außerdem werden die rekombinanten Proteine für die Strukturanalyse kristallisiert. Am Beispiel der prototypischen Zink-Peptidase Astacin erforschen wir die funktionellen Grundlagen der Astacine und Metzinkine durch zielgerichtete Mutagenese, Kristallstrukturanalyse von Mutanten und durch enzymkinetische Methoden. Astacine enthalten typischerweise ein katalytisches Modul von etwa 200 Aminosäureresten, dem eine Signalsequenz und eine Pro-Sequenz vorausgehen und dem oft regulatorische Domänen angehängt sind. Dies bedeutet, dass es sich hier um sezernierte Proteine handelt, die proteolytisch prozessiert werden müssen, um ihre aktive Konformation zu erhalten. Wir haben die inaktive Vorstufe des Astacins, das Proastacin, aus dem Flusskrebs isoliert und gleichzeitig als rekombinantes Protein in Bakterien exprimiert, um den Aktivierungsmechanismus aufzuklären.

Drittmittelgeber:

DFG

Beteiligte Wissenschaftler:

Prof. Dr. W. Stöcker (Leiter), Dr. I. Yiallouros, R. Kappelhoff

Veröffentlichungen:

Reyda, S, E Jacob, R Zwilling, W Stöcker: cDNA cloning, bacterial expression, in vitro renaturation and affinity purification of the zinc endopeptidase astacin. Biochem. J. 344, 851-857 (1999).

Yiallouros, I., E Große Berkhoff, W Stöcker: The roles of Glu93 and Tyr149 in astacin-like zinc peptidases. FEBS Lett. 484, 224-228 (2000).